肖志坚

骨髓增生异常综合征（MDS）是一组起源于造血干细胞阶段的髓系肿瘤[1]，自1982年FAB协作组提出MDS概念及其诊断分型标准以来，其诊断模式从形态学（M）到形态学、免疫学和细胞遗传学（MIC），再到形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学（MICM）模式的转变，分型诊断标准也不断地修订完善，从而使其更有助于临床预后判断和治疗方案的选择[2-5]。

1.细胞形态学

发育异常（dysplasia）是MDS的主要病理生理基础，其表征是显微镜下可辨识的细胞形态学异常，因此，细胞形态学依然是MDS诊断的基石[4]。如何理解细胞形态学在MDS的诊断中的作用和地位，以下几点值得关注：①细胞发育包括增殖和分化，MDS骨髓细胞增殖异常表现为细胞过渡凋亡，即骨髓涂片分类计数时某一系别过渡增生，但外周血该系别细胞计数却减少，同时骨髓涂片中可以见到该系别细胞“凋亡”的相关形态学异常。细胞的分化主要是通过细胞核的分裂来完成的，MDS骨髓细胞分化异常形态学主要是核的异常，如粒细胞系的假假性Pelger-Hüet样核异常、巨大分叶核中性粒细胞（macropolycytes)(至少达正常分叶核中性粒细胞大小的2倍）、不规则核过分叶（hypersegmentation）、胞核棒槌小体（4个以上，非性染色体相关的）和异常染色质凝集（大块状，有清亮区分隔），红系有核细胞的核间桥、不对称核、奇数核、核碎裂、分叶核等，巨核细胞系的微巨核细胞。MDS骨髓细胞分化的另一种异常是细胞分化的部分受阻，形态学表现为原始细胞计数比例增高。②细胞形态学不是限于骨髓穿刺涂片和外周血涂片的瑞氏染色的光镜下形态学，而是广义的细胞形态学，还包括骨髓和外周血涂片的细胞化学染色，如普鲁士蓝（铁）染色、有核红细胞糖原（PAS）染色、N-ALP等，此外，还有骨髓活检活组织切片的HE和/或Glemsa染色光镜下细胞形态学分析，以及骨髓活检活组织切片进行网状纤维（嗜银）染色、糖原（PAS）染色、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（CE）和普鲁士蓝（铁染色）染色等细胞化学染色，以及用CD34和CD61单克隆抗体进行免疫组织化学染色。

细胞形态学，特别是骨髓穿刺涂片和骨髓活检活组织切片光镜下细胞形态学分析的主要局限性是明显带有分析人员的主观性，同一涂片不同的阅片人可能得出不同的结论[6-8]。在我国以下几点尤须引起重视：①有些医院细胞形态学没有包括外周涂片的细胞形态学分析；②关于原始细胞，原红细胞和原巨核细胞不应作为原始细胞等同细胞归入原始细胞；③骨髓穿刺涂片中原始阶段的微巨核细胞和B祖细胞阅片经验不足的人员难以与原始细胞进行区分辨认，应结合CD41、CD42抗体进行免疫细胞化学染色和流式细胞术免疫表型分析等补充检查手段来加以鉴定。

2.流式细胞术免疫表型分析

流式细胞术免疫表型分析用于MDS的诊断的原理还是基于MDS的发育异常，骨髓细胞某一系别或某一系别细胞的某一特定分化成熟阶段的细胞抗原表达的异常[9-11]：①CD34+髓系前体细胞增多或表型异常，包括SSC增大，CD45、CD117、CD38等抗原表达减弱，异常表达CD7、CD56等；②成熟中性粒细胞常表现为CD11b、CD13或CD33的表达缺失或异常表达，CD16的延迟表达，表达CD56；③单核细胞异常有CD13、CD14、CD16或CD33的表达缺失或异常表达，CD11b或HLA-DR的异常表达，过表达CD56；④CD34+/CD10+或CD34+/CD19+细胞明显减少或缺如；⑤红系细胞有CD36和CD71的表达减低。流式细胞术免疫表型分析MDS骨髓细胞发育异常的敏感性高于细胞形态学分析。

尽管联合2个基于流式细胞术免疫表型分析的积分系统Ogata MFC-score和RED-score对原始细胞<5%的MDS的诊断敏感性和特异性分别达到了87.9%和88.9%，但由于迄今尚无MDS克隆细胞特异性抗原表达标志，以及尚无业内共识的抗体组合选择标准，因此，流式细胞术免疫表型分析依然是MDS诊断的一个辅助方法[9-11]。此外，由于血小板与巨核细胞抗原表达有交叉，因此，流式细胞术免疫表型分析不能用于巨核细胞发育异常的分析。还有，可能受骨髓取材“血液稀释”、溶血素体外处理检测标本对有核细胞的破坏等因素的影响，因此，特别强调不能用流式细胞术免疫表型分析CD34+细胞比例取代骨髓和外周血涂片细胞分类计数的原始细胞比例来进行MDS的分型诊断。

3.细胞遗传学

MDS的诊断，除寻找造血细胞发育异常的证据外，另一重要点就是寻找克隆性造血的证据。自1966年Rowley首次报道白血病前期（preleukemia）患者有C组染色体克隆性异常以来，非随机染色体核型异常就成了MDS克隆性造血的一个主要标志。其主要不足有：①仅约40%～60%的MDS患者具有非随机的染色体核型异常，其中以+8、-7/del(7q)、del(20q)、-5/del(5q)和-Y最为多见；②+8、del(20q)和-Y可见于正常人（特别是老年人）、再生障碍性贫血等情况，对诊断缺乏特异性；③骨髓低增生、合并骨髓纤维化的患者常难获得足够的（20个）可供分析的中期细胞分裂像。

现阶段在我国以下几点值得加以强调：①所有疑诊MDS的患者均应做常规（G带或R带）染色体核型分析；②不能用FISH检测取代常规染色体核型分析，对疑似MDS者且骨髓干抽、无中期分裂相、分裂相质量差或可分析中期分裂相<20个时，采用包括5q31、cep7、7q31、cep8、20q、cepy和p53的组合探针行fish检测，作为常规染色体核型分析的补充[12]；③SNP-array等基因芯片技术在检测DNA拷贝数异常和单亲二倍体方面的敏感性高，可进一步提高MDS患者细胞遗传学异常的检出率，可作为常规核型分析的有益补充，SNP-array与FISH检测的共同缺陷是仅能分析染色体的数量异常，且受所使用探针的限制，不能发现染色体易位异常。

4.分子生物学

随着二代测序在临床中的广泛应用，MDS的基因突变谱系已基本明确[13-15]: ①MDS的受累基因约60个，包括RNA剪切、DNA甲基化、染色质重塑、转录因子、DNA修复、粘合素和RAS信号途径等几大类基因，最常受累基因有SF3B1、TET2、 SRSF2、 ASXL1、DNMT3A和RUNX1，这些基因突变频率均在10%以上；②基因突变检出率约85%～90%，只要符合MDS诊断标准，即使骨髓原始细胞为0，也存在有基因突变，大部分患者存在2个或2个以上基因突变，基因突变数随骨髓原始细胞比例的增高不断增多，基因突变负荷，较高危组患者也明显高于较低危组患者。近年，依据基因突变作为克隆性造血的标志，提出了“潜质未定的克隆性造血（CHIP）”、“克隆性意义未定的血细胞减少（CCUS）”等可能发展为MDS的前驱疾病。因此，基因突变作为克隆性造血的标志用于MDS的诊断已列入常规。

尽管SF3B1基因突变已列入WHO（2016）标准中“MDS伴环状铁粒幼红细胞（MDS-RS）”亚型的一个诊断标准，但基因突变用于MDS的诊断现阶段还存在以下挑战[14,15]：①除SF3B1基因突变以外，其他基因突变尚不符合某一亚型检出率高、检出该基因对某一亚型具有特异性等作为分型诊断的要求，因而仅能作为克隆性造血的证据辅助MDS的诊断；②已有研究发现，即使在成年人MDS，DDX41、GATA2、RUNX1等基因突变可能为胚系突变，而非获得性体细胞突变，由于受卫生经济学瓶颈的限制，在日常临床实践中每一位患者采用指甲、毛囊、口腔粘膜对“正常组织”对照同时进行基因突变分析的可能性较小；③有些基因突变检出率较低，现今尚无一个共识的检测基因组套共识方案；④一般医院均无“遗传基因咨询师”，临床医师可能存在对检测结果“误读”的可能。

5.结语

MDS诊断的3个关键词是外周血细胞计数减少、发育异常和克隆性造血。细胞形态学和流式细胞术免疫表型分析用于寻找发育异常证据，后者是前者的有力补充。细胞遗传学和分子生物学可提供克隆性造血的证据，前者是常规，后者检出率更高。针对MDS诊断方法学的缺陷，在未来的主要发展趋势是：①采用人工智能（AI）形态学分析方法，这样判断标准更客观、统一；②进一步规范流式细胞术免疫表型分析和基因突变的方法学；③随着组学在临床的应用，有可能诞生一个组学的诊断、分型体系。

参考文献

1.肖志坚。骨髓增生异常肖志坚2018观点。北京：科学技术文献出版社，2018.7，第一版2.肖志坚。骨髓增生异常综合征的精确诊断。中华血液学杂志，2015,36（5）：361-362。

3.Valent P , Orazi A , Steensma DP , et al. Proposed minimal diagnostic criteria for myelodysplastic syndromes (MDS) and potential pre-MDS conditions. Oncotarget 2017,8:73483-3500.

4.肖志坚。从dysplasia来理解骨髓增生异常综合征。中华血液学杂志，2018,39:177-178。

5.Weinberg OK, Hasserjian RP. The current approach to the diagnosis of myelodysplastic syndromes.Semin Hematol, 2019, 56:15-21。

6.肖志坚。正确认识细胞形态学在骨髓增生异常综合征诊断中的地位。诊断学理论与实践，2013，12:1-3。

7.Font P , Loscertales J , Soto C , et al. Inter-observer variance in myelodysplas- tic syndromes with less than 5% bone marrow blasts: unilineage vs. multilineage dysplasia and reproducibility of the threshold of 2% blasts. Ann Hematol, 2015, 94:565-573.

8.Hodes A, Calvo KR, Dulau A, et al. The challenging task of enumerating blasts in the bone marrow.Semin Hematol, 2019, 56:58-64.

9.Alhan C, Westers TM, Cremers EM, et al. Application of flow cytometry for myelodysplastic syndromes: Pitfalls and technical considerations.Cytometry B Clin Cytom, 2016 , 90:358-367.

10.Bento LC, Correia RP, Pitangueiras Mangueira CL,et al. The Use of Flow Cytometry in Myelodysplastic Syndromes: A Review.Front Oncol, 2017,7:270.

11.Della Porta MG, Picone C.Diagnostic Utility of Flow Cytometry in Myelodysplastic Syndromes.Mediterr J Hematol Infect Dis, 2017, 9:e201701.

12.曲士强，徐泽峰，李承文等。FISH在骨髓增生异常综合征患者细胞遗传学评估中的作用。中华血液学杂志，2012,33：839-842。

13.李冰，王静雅，刘晋琴等。靶向测序检测511例骨髓增生异常综合征患者基因突变。中华血液学杂志，2017,38：1012-1016。

14.Bejar R. Myelodysplastic Syndromes Diagnosis: What Is the Role of Molecular TestingCurr Hematol Malig Rep, 2015, 10:282-291.

15.Steensma DP. How I use molecular genetic tests to evaluate patients who have or may have myelodysplastic syndromes.Blood, 2018, 132:1657-1663.

作者：肖志坚

编辑：曲晓宁