近年来，基因治疗、免疫治疗和再生医学等领域不断取得重大突破。经CRISPR技术进行基因编辑后的人多潜能干细胞iPSC，经过基因修饰、可靶向识别肿瘤的CAR-T细胞等具有重要临床应用价值，但由于这些细胞基因编辑效率（特别是HDR或精准基因插入效率）有限，阻碍其在临床上的广泛使用[1,2]。因此，探究细胞基因编辑后动力学修复机制，并有效提高HDR效率，是细胞治疗应用于临床需要解决的一个瓶颈问题。
2021年1月25日，中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）实验血液学国家重点实验室张孝兵/程涛/张磊团队在《核酸研究》杂志发表题为“Dynamics and competition of CRISPR–Cas9 ribonucleoproteins and AAV donor-mediated NHEJ, MMEJ and HDR editing”的研究论文，首次揭示了CRISPR-Cas9核糖核蛋白联合AAV供体进行基因编辑后NHEJ、MMEJ及HDR各编辑结果间动力学竞争关系。
当DNA双螺旋结构断裂后，细胞会立即启动DNA损伤修复机制，主要包括经典的非同源末端连接（c-NHEJ/NHEJ）、非传统的末端连接或微同源介导的末端连接（alt-EJ/MMEJ）和同源模板指导的精确修复（HDR）等[3]。DNA断裂修复过程可能会破坏基因的开放阅读框，造成等位基因敲除。在提供HDR模版的情况下，可实现基因的精确敲入。目前，HDR供体主要包括质粒、单链寡脱氧核糖核苷酸（ssODN）和AAV等。
使用RNP和AAV6 HDR供体模板进行精确HDR编辑的示意
作者在成人外周血重编程来源的iPS细胞、原代T细胞、人慢性髓性白血病细胞株K562细胞和单核白血病细胞株U937等四种细胞类型中，对超过80个位点进行基因编辑，然后在不同的时间点收集细胞，PCR扩增编辑位点临近序列，进行高通量测序分析，获得编辑模式的详细图谱（上图）。结果表明，不同导向RNA（gRNA）、不同细胞类型间基因编辑效率和模式存在明显差异。将RNP电转后5个连续时间点的各个代表性DNA修复情况的频率绘制成图，取效率达到最大值的一半（50%）时的时间数值作为该编辑情况的T50，统计分析得出在四种细胞中各个代表性修复途径的发生速度。作者发现CRISPR-Cas9基因编辑后，NHEJ的发生速度最快，接下来是HDR，而MMEJ修复最慢，这就解释了基因编辑后经常发生高比例A/T（腺苷酸或胸腺嘧啶）插入的原因。当提供AAV6 HDR供体模版时，MMEJ介导的长片段缺失显著减少，但NHEJ介导的插入缺失不受影响。
由于NHEJ是修复DNA断裂损伤最主要且快速的修复途径，一定程度上阻碍了HDR的发生，作者期望寻找有效的NHEJ抑制剂提高HDR的效率。经过对14种小分子药物及其不同组合的测试，首次报道两种小分子M3814（NHEJ抑制剂）和Trichostatin A（TSA，HDAC抑制剂）的组合能够有效抑制NHEJ，提高了期望的HDR编辑结果。M3814+TSA这种小分子化合物组合适用于多种细胞（在人iPSC和T细胞中提高HDR效率2～4倍）以及多种模板载体（质粒载体及AAV载体）。
总之，该研究首次揭示了CRISPR RNP-AAV系统基因编辑后NHEJ、MMEJ及HDR各编辑结果间动力学竞争关系，利用M3814+TSA小分子组合抑制NHEJ+A/T将成为多种细胞类型中提高HDR效率的通用策略，从而实现CRISPR基因编辑技术的普遍应用。
中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）实验血液学国家重点实验室张孝兵教授、程涛教授和血栓止血诊疗中心张磊教授是本文的共同通讯作者。中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）博士生傅雅文、代新岳和助理研究员王文天为本文的共同第一作者。
[1] Kim, M.Y., Yu, K.-R., Kenderian, S.S., Ruella, M., Chen, S., Shin, T.-H., Aljanahi, A.A., Schreeder, D., Klichinsky, M. and Shestova, O. (2018) Genetic inactivation of CD33 in hematopoietic stem cells to enable CAR T cell immunotherapy for acute myeloid leukemia. Cell, 173, 1439-1453. e1419.
[2] Lu, Y., Xue, J., Deng, T., Zhou, X., Yu, K., Deng, L., Huang, M., Yi, X., Liang, M., Wang, Y. et al. (2020) Safety and feasibility of CRISPR-edited T cells in patients with refractory non-small-cell lung cancer. Nat Med, 26, 732-740.
[3] Chapman, J.R., Taylor, M.R. and Boulton, S.J. (2012) Playing the end game: DNA double-strand break repair pathway choice. Mol Cell, 47, 497-510.
撰稿：代新岳
编辑：柴子越
校对：徐龙彪
审核：祁健伟 周家喜