人类已经发现6000多种遗传性疾病，其中大部分只能通过基因治疗才能彻底治愈疾病。基因治疗是指利用基因转移或基因调控的手段向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段以修饰或纠正，抑制、关闭或消除异常的致病基因，从而达到根治疾病目的的一种方法。过去30年，科学家发明了多种基因治疗方法，比如利用重组病毒载体作为基因转运的工具，但是在疗效和安全性上都存在很多问题。最近几年，精准高效的CRISPR-Cas9基因编辑技术的出现加速了基因治疗临床转化的步伐。

CRISPR-Cas9基因编辑技术是21世纪最重要的技术革命之一，在2013年大放异彩，作为一个基因编辑的利器，它是进行基因治疗的理想工具。CRISPR-Cas9又称为魔剪，是精确识别和切割DNA的分子剪刀。人体每个细胞的DNA都包含有来源于父母的60亿个A、G、T、C碱基对，它们编码了生命的全部秘密。类似于精确制导导弹，魔剪只切割数十亿个潜在位点中的一个或一对位点。CRISPR基因编辑的基本工作原理是：Cas9核酸内切酶与向导RNA(sgRNA)形成复合物，sgRNA与DNA进行碱基配对后，Cas9核酸内切酶对DNA进行切割造成DNA双链断裂。在无同源重组模板的情况下，细胞通过非同源末端链接的方式进行自我修复；如果同时导入人工设计的包含特定基因或DNA片段的同源重组引导模板，就可以诱使细胞通过同源重组的途径来修复DNA双链断裂，在这一过程中，人们可以得到理想的精确基因编辑结果。

CRISPR-Cas9基因编辑技术有望治愈数以千计的遗传性疾病，但目前编辑效率较低，尤其是大片段精准敲入。而某些遗传疾病(如血友病A)需要高效率地将大片段DNA敲入才能治愈疾病，这就限制了基因编辑技术的应用。程涛教授和张孝兵教授联合课题组近几年致力于CRISPR-Cas9基因编辑特异性和基因编辑高效性的研究。研究团队围绕优化CRISPR-Cas9基因编辑技术的效率开展了一系列工作。研究发现，减少sgRNA识别靶序列的长度可以提高打靶特异性，但是在干细胞中缩短sgRNA长度可能会降低Cas9切割效率，因此在特异性和功效之间需要有一个合理的平衡。高通量测序研究还发现，优化设计的sgRNA在原代细胞中的脱靶(Off-target)切割极低，因此CRISPR基因编辑在临床应用中的安全性可能明显高于早期预测。同时还发现，在同源重组模板的同源臂两端引入切割位点可使基因敲入效率提高5-10倍。这一结果在多种细胞系和多个实验室都可以重现，提示这一设计理念的普适性。这些研究成果已经发表在《Scientific Reports》(2016)和《Genome Biology》(2017)上。

研究团队还致力于研究人多能干细胞iPSC。通过对转基因载体进行技术改造，成人外周血细胞重编程为多能干细胞的效率提高了100倍，为目前世界最高水平，这将为干细胞的临床转化奠定基础。这一血细胞重编程载体系统已经被全世界数十家实验室采用。iPSC还对研究疾病的发病机理，体外药物筛查以及开发新的治疗手段具有重要意义。为了充分发挥iPSC的潜在价值，还需要对iPSC进行特定的基因修饰。为简化流程、提高效率，他们整合了重编程载体系统和CRISPR-Cas9基因编辑载体系统。优化后的系统可使重编程和基因编辑同步完成，而且最高编辑效率可达50%。这不仅将加速基于iPSC的基础研究，而且为临床再生医学提供了新的思路。相关研究成果发表在《Stem Cell Reports》(2016,2018)和《J Vis Exp》(2017)等杂志上。

在早期的研究中，人们通常使用肿瘤细胞系作为模型，这些细胞系很容易进行操作，基因编辑效率通常也很高(10%以上)。但对于具有重要研究和应用价值的细胞，比如人iPSC，基因编辑效率通常低于1%，这已经成为制约干细胞领域快速发展的一个瓶颈。在iPSC中编辑效率低的主要原因是，在导入质粒等编辑元件后，99%的细胞很快死亡。为此，研究团队深入研究了在电穿孔把质粒DNA导入细胞过程中iPSC的死亡机理，并且找到了保护多能干细胞死亡的简单方法—只需要在基因编辑过程中加入抗凋亡基因BCL-XL，细胞存活率和基因编辑效率就可提高10-50倍，最高精准敲入效率达50%以上。通过引入巧妙的筛选方法，基因敲除效率可达100%，基因敲入效率可达95%以上。这些方法为干细胞研究人员提供了简便、快捷的研究工具，使iPSC基因修饰或建立iPSC报告细胞系的效率提高5-10倍。2018年9月，论文在《Nucleic Acids Research》发表后，很快引起了多国科学家和社交媒体的关注。

尚未发表的数据显示，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术和新型精准基因编辑引导载体，可以完全治愈血友病A小鼠，疗效稳定超过1年，相当于终生治愈。血友病A是由于凝血因子F8功能缺失导致的严重出血性疾病。中国现有数万血友病A患者，目前的常规F8替代治疗方案可以减少出血发生，但需要每周静脉注射2-3次，而且每年治疗费用超过30万元，是患者家庭和中国医疗系统的沉重负担。血友病体内基因编辑治疗方案一旦走向临床，不仅将为数万家庭带来福音，而且将为国家医疗保障系统节约数百亿元。

利用类似的技术，还有望显著提高造血干细胞基因编辑的效率，最终治愈地中海贫血等依赖于造血干细胞移植的疾病。地中海贫血又称珠蛋白生成障碍性贫血，是一组遗传性溶血性贫血疾病，在东南亚和我国南方高发。另外，最近几年的大量临床试验结果表明，杀伤性T淋巴细胞经过基因修饰后的CAR-T细胞可有效治愈多种恶性血液病。尚未发表的数据显示，利用优化的方法，在人造血干祖细胞和原代T细胞中的精确基因插入效率可达20-50%，这为未来开展地中海贫血基因治疗和CAR-T细胞基因治疗奠定了基础。利用基因编辑方法，而不是目前常用的具有安全隐患的慢病毒载体，不仅将大大提高细胞治疗的安全性，而且预期会显著提高疗效。

为加速基因治疗的临床转化，中国医学科学院已经在血液学研究所内组建血液病基因治疗重点实验室，主任为临床血液学家、凝血科主任医师张磊教授。

上述研究成果的主要完成人包括：张健萍、温伟、许静、李晓兰、李国华、傅雅文、程新新等。

参考文献

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6. Li XL*, Li GH*, Fu J*, Fu YW, Zhang L, Chen WQ, Arakaki C, Zhang JP, Wen W, Botimer GD, Baylink D, Aranda L, Choi H, Bechar R, Talbot P, Sun CK#, Cheng T#, Zhang XB#. Highly-efficient genome editing via CRISPR-Cas9 in human pluripotent stem cells is achieved by BCL-XL. Nucleic Acid Research, 2018 Sep 20. doi: 10.1093/nar/gky804.